Our visit to the laboratories of Pharmacology, Department of Science Health, University of Milan

On January 20th 2014 the Cure Girls went to visit the labs of pharmacology of the university of Milan and met with Dr. Daniele Bottai. He showed us the new labs and gave us an interview to explain what his team is working on with regards to a cure for SCI.

1. Can you briefly describe the research that you are doing in relation to spinal cord injury?

When in 2006, I moved at the University of Milan, I have begun to get interested in Spinal Cord Injury (SCI) using a new (at the time) “drug”: neural stem cells. Between 2002 and 2006, I worked in the Laboratory of Professor Angelo Vescovi where I learned to manipulate neural stem cells (from different regions of the brain) both human and mouse.

In these 8 years spent to the University of Milan we have been studying the role of different types of stem cell in transplantation in animal model of SCI, in particular, we have studied the effects of murine embryonic and neural stem cells and human amniotic fluid (AFCS ) with the purpose to find the sources of stem cells that were an available source and with the appropriate characteristics for the treatment of neurological diseases .

In general, we can say that these cellular processes (performed in acute spinal cord lesion) have positive effects and are significant from a functional and morphological point of view. After treatment with the cells listed above, the mice returned to walk (albeit not the same as they did before the lesion); while lesioned not treated animals are able to move their hind limbs, but not to walk. (These results have been summarized in three scientific papers:

D. Bottai, D. Cigognini, L. Madaschi, R. Adami, E. Nicora, M. Menarini, A.M. Di Giulio, A. Gorio (2010).Embryonic Stem Cells Promote Motor Recovery and Affect Inflammatory Cell Infiltration in the Spinal Cord Injured Mice Experimental Neurology 223, 452-463 ;

D.  Bottai , L. Madaschi, A.M. Di Giulio and A. Gorio. (2008) Viability -Dependent Promoting Action of Adult Neural Precursors in Spinal Cord Injury . Molecular Medicine , 14 (9-10), 634-644.

 On the bases of these results, we asked what was the mechanism that caused this improvement.

The answer was that in this model the role of animal cells is purely trophic and they are not going to replace, if not in small portion, damaged or dead cells.

Various are the trophic molecules (cytokines) that are involved in this phenomenon. Recently, we have focused our attention on amniotic fluid cells. We chose this cell type because their availability since the at term cesarean delivery could represent an unlimited source of stem cells with no ethical issues and few risks for the child and the mother.

In a work that a few days ago has been accepted for publication (D. Bottai , G. Scesa , D. Cigognini, R. Adami , E.. Nicora, S. Abrignani, A.M. Di Giulio, and A. Gorio Third trimester amniotic fluid NG2 -positive cells are effective in improving on repair in spinal cord injury. Experimental Neurology.) we have shown that a trophic factor, produced by the AFCS, which is important for the induction of the morphofunctional recovery, was the hepatocyte growth factor (HGF) and that this cytokine was produced only by particular sub- populations of our cells or those expressing on their surface the NG2 protein (a membrane proteoglycan). Such a membrane protein can be hopefully used in the future to select from the amniotic fluid liquid the cells that express NG2 and so have a therapeutic action.

We are currently investigating what is the correlation between NG2 and HGF.

2. Acute injury or chronic injury present any difference for a research approach? Could you explains the differences and the advantages and disadvantages.

I do not think we can talk about differences between acute and chronic lesion in terms of advantages and disadvantages. These are two different pathological conditions, the acute progress into the chronic with the passage of time mostly because there is a de- myelination process.

In this context, we are dealing with two different types of patients the acute ones, namely that a few days or weeks have suffered damage to the spinal cord which have a very extensive inflammatory condition that exacerbates the primary mechanical injury further damaging the tissue and those, who instead, underwent chronic spinal cord injury for more time (months and years) in which degeneration induced by primary damage and the secondary SCI causes the formation of a cavity surrounded by the glial scar that separates the lesion from the undamaged tissue and prevent nerve regeneration.

Currently the researcher and clinician are faced with these types of patients because in the first instance they have not been able to prepare effective therapies to treat acute patients.

The therapeutic approach to the patient who recently underwent spinal damage is intended to reduce the compression state and to control the secondary damage due to inflammation through the drug methylprednisolone, inter alia, that approach does not seem to have a sufficient efficacy, as evidenced by the fact that the number of chronically para or quadriplegics is unfortunately increasing.

In the chronic patient instead we find ourselves facing a very different situation with the blood-brain barrier that is closed, and a glial scar consisting mainly of fibroblasts from the meninges and reactive astrocytes that produce proteoglycans (extracellular matrix molecules) that are responsible for the inhibition growth of axons.

In this situation, the therapeutic approach is vastly different from that prepared in the state of acute spinal cord injury.

In fact, removal (either mechanical – surgical or enzymatic) is a sine qua non con-diction in order to prepare any kind of intervention to restore or replace dead or damaged cells and rebuild the axons making them grow in the appropriate direction.

In this context, the treatment of chronic patients need multiple concurrent interventions:

  1.   Treatment with drugs that induce axonal regeneration;
  2.   Treatment with drugs that reduce the inhibitory effects of glial scar both mechanical and enzymatic chondroitinase that due to factors such as chemical inhibitors, blockers of Nogo and other myelin components;
  3.   Treatment with cells or systems consisting of nanomaterials and cells.

Some of these approaches were ineffective few years ago but in the light of developments in nanomaterials and new types of stem cells I think it might be appropriate to re-examine these pathways.

3. How do you think we can solve the problem of scar?

As I mentioned in the previous answer, in order to find an approach that leads to the recovery of sensory and motor pathways, it is necessary to make the scar area permissive for the survival of cells that are transplanted and that would allow axonal growth in the manner to ensure the recovery of the routes of transmission.

With this in mind, scar removal is definitely needed and should be prepared to minimize the risk of inducing further damage.

In this context, the experimental work in the preclinical phase or with animal models is essential but at the same time very complex given that small animals have practical difficulties of intervention and larger animals have problems is housing costs that are beyond the economical capability of most the laboratories that I know.

Finally, the translation of the results obtained in the preclinical stage is very difficult for a variety of patients such as those with spinal cord injury whose disease is highly variable due to the fact that the damage is very random and therefore leads to differences between the patient and the other.

4. Can you apply your research to Chronic Spinal Cord Injury?

The applicability of the cells in the amniotic fluid in models of chronic spinal cord injury must be verified experimentally, so I can say a priori that such an intervention can be prepared but obviously need the appropriate adjustments of the experimental protocol. In fact, while in the acute model we have a purely trophic action in the case of chronic treatment the intervention should be at the level of local scar in order to determine whether these cells could contribute to modify the scar itself and reconstitute the ways by means of the differentiation in cells central nervous system (neurons, oligodendrocytes and astrocytes) or by inducing endogenous stem cells to differentiate into mature cells. In this context, previous treatment with chondroitinase could improve the success of the experiment.

5. Do you have collaborations with other research institutions ? Which ones?

As I mentioned in our discussion in the institute , I believe that partnerships are the lifeblood of research. In recent years I have had collaborations with various research groups and consortia. Firstly put the FUNGENES: Functional Genomics of Human Embryonic Stem Cells; funded by the European Economic Community, Sixth Framework Programme. (€ 500,000 for 3 years) (in collaboration with Prof. A.L. Vescovi of which I was the deputy). This project was set out to investigate the characteristics proliferative and differentiative of stem cells (especially embryonic). This project involved and brought together about a dozen institutions across Europe and basically was the first step that allowed me to improve my knowledge on stem cells.

– Study of functional recovery induced by transplantation of neural stem cells in animal models of acute spinal cord contusion, funded by Fondazione Cariplo.(€ 300,000 for 2 years) (Coordinator Prof. A.L. Vescovi).

It was a project that introduced me in the world of spinal cord injury, and thanks to Prof. Vescovi, the project that make me chose to continue the research in neurodegenerative diseases

– Neural stem cells: a new approach to mobile spinal muscular atrophy; Asamsi non-profit organization funded by foundations and Families of SMA Italy . (Head with Prof. A. L. Vescovi) .

I am also currently working on the project “Role of stem cells in the treatment of glaucoma” (glaucoma is a neurodegenerative disease) with Professor Mario Luca Rossetti, which conducts clinical and research in my department and with Dr. Valentina Massa (which also works in my department) for a study of neurological disorders.

6. What are the steps needed to translate your result in human?

To start a clinical trial phase 1-2, that provide the safety analysis (which most likely this type of cells have since they belong to the class of mesenchymal which have already been extensively tested in several clinical trials) and effectiveness, our results must be first validated in other laboratories. Subsequently, it will be necessary to derive the cells so that they are compatible with the transplant in humans that means that the cells must satisfy conditions of Good Manufacturing Practice (GMP ) that involves the use of materials “human grade” in order to reduce the risk to the patient (for pathologies as the well- known prion disease such as mad cow disease. This procedure is currently out of our economical availability as it requires economical conditions of sterility and purity that we cannot get unless you build the appropriate laboratories.

7. Is there any particular obstacle that slows down your work?

The current financial situation of our country, where the cuts have affected many strategic sectors of the economy and cultural is experienced by us researchers, with much apprehension. While it is true that funding should be allocated to those who do the research and then excellence must be a prerequisite for this contingency (Italian and international), cuts in recent time unfortunately affected groups or researchers that produce high quality work. So there is now the hope that this trend may change and that organizations and associations (onlus) can help the researcher by funding specific projects.

We thank Dr. Bottai for his precious work and for giving us the opportunity to visit the center and for answering our questions.

Cure Girls Arcangela, Marina and Loredana

 

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Visita ai laboratori di farmacologia dell’ospedale San Paolo di Milano – Intervista al Dr. Bottai

Lunedì 20 gennaio le Cure Girls sono state in visita ai laboratori di farmacologia dell’ospedale San Paolo di Milano.

Di seguito potrete leggere l’intervista che ci ha gentilmente rilasciato il Dr. Daniele Bottai.

  1. Dr. Bottai ci descrive brevemente la ricerca che state portando avanti in merito alle lesioni spinali?

“Da quando, nel 2006, mi sono trasferito all’Università degli Studi di Milano ho iniziato ad interessarmi di Lesione Spinale utilizzando un nuovo (a quei tempi) strumento “farmacologico”: le cellule staminali neurali. Avevo lavorato per 3 anni nel Laboratorio del Professor  Angelo L. Vescovi e avevo imparato a manipolare le cellule staminali neurali (cioè provenienti da alcune regioni del cervello) sia umane che di topo.

In questi 8 anni passati all’Università degli Studi di Milano siamo riusciti a studiare il ruolo di diversi tipi di cellule staminali nel trapianto in animali cha avevano subito una lesione spinale, in particolare abbiamo studiato gli effetti di cellule staminali neurali e embrionali murine e umane del liquido amniotico (AFCs) con il proposito di trovare delle fonti di cellule staminali che fossero facilmente reperibili e con le appropriate caratteristiche per il trattamento di patologie neurologiche.

In generale possiamo dire che questi trattamenti cellulari (effettuati in acuto) hanno effetti decisamente positivi e statisticamente significativi da un punto di vista funzionale (motorio) e morfologico. Dopo trattamento con le cellule sopra elencate, i topi tornano a camminare (anche se in maniera non uguale a come facevano prima della lesione); mentre gli animali lesionati e non trattati sono in grado di muovere gli arti posteriori ma non di camminare. Questi risultati sono stati riassunti in 3 lavori scientifici:

Bottai D., Cigognini D., Madaschi L., Adami R., Nicora E., Menarini M., Di Giulio A. M., Gorio A. (2010). Embryonic Stem Cells Promote Motor Recovery and Affect Inflammatory Cell Infiltration in Spinal Cord Injured Mice. Experimental Neurology 223; 452–463;

Bottai D., Madaschi L., Di Giulio A. M. and Gorio A.. (2008) Viability-Dependent Promoting Action of Adult Neural Precursors in Spinal Cord Injury. Molecular Medicine, 14(9-10); 634-644.

In base a questi risultati ci siamo quindi chiesti quale fosse il meccanismo che induceva questo miglioramento nell’animale.

La risposta è stata che in questo modello animale il ruolo delle cellule è prettamente trofico e esse non vanno a sostituire, se non in minima parte, le cellule danneggiate o morte.

Varie sono le molecole trofiche (citochine) che sono coinvolte in questo fenomeno. Recentemente ci siamo concentrati sulle cellule del liquido amniotico. Abbiamo scelto questo tipo di cellule poiché la disponibilità di liquido amniotico da parti cesarei a termine è pressoché illimitata e non presenta problematiche di natura etica ed esigui rischi per il nascituro al momento del prelievo.

In un lavoro che pochi giorni fa ci è stato accettato per pubblicazione (Bottai D., Scesa G., Cigognini D., Adami R., Nicora N., Abrignani S., Di Giulio A.M., and Gorio A. Third trimester NG2-positive amniotic fluid cells are effective in improving repair in spinal cord injury. Experimental Neurology ) abbiamo dimostrato che un fattore trofico, prodotto dalle AFCs, importante per l’induzione del recupero morfofunzionale era il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e che questa citochina veniva prodotta solo da particolari sub popolazioni delle nostre cellule ovvero quelle che esprimevano sulla loro superficie la proteina NG2 (un proteoglicano di membrana). Tale proteina di membrana potrà essere, si spera, utilizzata in futuro per selezionare tra le cellule del liquido amniotico quelle che hanno una azione terapeutica. Attualmente stiamo studiando quale sia la correlazione tra NG2 e HGF.”

2.      Ricerca su lesione acuta o su lesione cronica: ci spiega la differenza? Vantaggi e svantaggi.

“Non credo che possiamo parlare di differenze tra lesione acuta e cronica in termini di vantaggi e svantaggi, sono due condizioni patologiche diverse, ovviamente l’acuta progredisce nella cronica con il passare del tempo con un danno che è prevalentemente di de-mielinizzazione.

In questo contesto ci troviamo di fronte a due differenti tipologie di pazienti ovvero quelli acuti e cioè che da pochi giorni o settimane hanno subito il danno al midollo spinale i quali sono in uno stato infiammatorio molto pronunciato che esacerba il danno meccanico primario danneggiando ulteriormente il tessuto e quelli cronici che invece hanno subito il danno spinale da più tempo (mesi ed anni), in cui la degenerazione indotta dal danno primario e quello secondario della SCI causa la formazione di una cavità circondata dalla cicatrice gliale che separa la lesione dal tessuto non danneggiato ed impedisce la rigenerazione nervosa.

Attualmente il ricercatore ed il clinico si trovano davanti a queste due tipologie di pazienti poiché in prima istanza non sono stati capaci di approntare terapie efficaci per trattare i malati acuti.

L’approccio terapeutico per il paziente che da poco ha subito il danno spinale è indirizzato alla riduzione dello stato di compressione e al controllo del danno secondario dovuto all’infiammazione tramite il farmaco metil-prednisolone, approccio fra l’altro che non pare essere di una sufficiente efficacia, come si capisce dal fatto che il numero di para o tetraplegici cronici sta, purtroppo aumentando.

Nel paziente cronico invece ci troviamo di fronte ad una situazione ben differente con la barriera ematoencefalica che si è richiusa ed una cicatrice gliale costituita principalmente da fibroblasti provenienti dalle meningi e astrociti reattivi che producono proteoglicani (molecole della matrice extracellulare) che sono responsabili dell’inibizione della crescita di assoni.

In questa situazione l’approccio terapeutico è enormemente differente da quello approntato nello stato acuto della lesione spinale.

Infatti la rimozione (sia essa meccanico-chirurgica che enzimatica) è condizione sine qua non per poter approntare un qualsiasi tipo di intervento volto a ricostituire o rimpiazzare le cellule morte o danneggiate e a ricostruire gli assoni facendoli crescere nell’appropriata direzione.

In questo contesto il trattamento del paziente cronico necessita di più interventi concomitanti:

1)  Trattamento con farmaci che inducano la rigenerazione assonale;

2)  Trattamento con farmaci che riducano gli effetti inibitori della cicatrice gliale sia meccanici che enzimatici con condroitinasi che dovuti a fattori chimici inibitori come bloccanti di Nogo e altri componenti della mielina;

3)  Trattamento con cellule o sistemi costituiti da nanomateriali e cellule.

Alcuni di questi approcci qualche anno fa sono risultati inefficaci ma alla luce degli sviluppi dei nanomateriali e di nuove tipologie di cellule staminali credo che potrebbe essere appropriato ridiscutere queste vie.”

3.      Come pensate si possa risolvere il problema della cicatrice?

“Come ho già accennato nella precedente risposta, affinché si possa pensare ad un approccio che porti alla ricostituzione delle vie sensitive e motorie, occorre rendere la zona della cicatrice permissiva alla sopravvivenza di cellule che vi vengano trapiantate e che possa permettere la crescita assonale con le modalità atte a garantire la ricostituzione delle vie di trasmissione.

Con tale intento la rimozione della cicatrice è sicuramente necessaria e va approntata riducendo al minimo il rischio di indurre nuovi danni.

In questo contesto il lavoro sperimentale in fase preclinica ovvero con modelli animali è essenziale ma al contempo molto complesso dato che animali di piccole dimensioni presentano difficoltà pratiche di intervento e animali più grandi presentano delle problematiche sia di stabulazione e costi che sono fuori dalla portata della gran parte dei laboratori che conosco.

Infine la traduzione dei risultati ottenuti in fase preclinica è molto difficile per una tipologia di pazienti come quelli che hanno la lesione spinale la cui patologia è molto variabile a causa del fatto che il danno è molto casuale e quindi porta a differenze tra un paziente e l’altro”.

4.      Si può applicare la vostra ricerca alle Lesioni Spinali Croniche?

“L’applicabilità delle cellule nel liquido amniotico in modelli di lesione spinale cronica deve essere verificata sperimentalmente quindi a priori posso dire che tale intervento può essere approntato ma ovviamente con gli appropriati aggiustamenti di protocollo sperimentale. Infatti, mentre nel modello acuto noi abbiamo una azione prettamente trofica, nel caso del cronico si potrebbe eventualmente ipotizzare un trattamento locale a livello della cicatrice allo scopo di verificare se queste cellule possano contribuire a modificare la cicatrice stessa e a riformare le vie danneggiate sia differenziandosi in cellule del sistema nervoso centrale (neuroni, oligodendrociti e astrociti) oppure inducendo le cellule staminali endogene a differenziarsi in cellule mature. In questo contesto il precedente trattamento con condroitinasi potrebbe migliorare la riuscita dell’esperimento.”

5.      Avete collaborazioni con altri istituti di ricerca? Quali?

“Come ho accennato nella nostra discussione in istituto, ritengo che le collaborazioni siano la linfa vitale della ricerca, in questi anni ho avuto collaborazioni con vari gruppi di ricerca e consorzi. In primis metterei il progetto Fungenes: Functional Genomic of non Human Embryonic Stem Cells; finanziato dalla Comunita Economica Europea, VI Programma Quadro. (500000 € per 3 anni) (in collaborazione con il Prof. A. L. Vescovi di cui ero il deputy (viceresponsabile)). Tale progetto si prefiggeva di studiare caratteristiche proliferative e differenziative delle cellule staminali. Tale progetto coinvolgeva e raggruppava circa una ventina di istituti in tutta Europa e fondamentalmente è quello che mi ha permesso di meglio affinare le mie conoscenze sulle cellule staminali.

-Studio del recupero funzionale indotto dal trapianto di cellule staminali neurali in modelli animali acuti di contusioni del midollo spinale; finanziato dalla Fondazione Cariplo. (300000 € per 2 anni) (Coordinatore il Prof. A. L. Vescovi).

E’ stato un progetto che mi ha poi introdotto nel mondo della lesione spinale, e al quale devo, grazie all’aiuto del Prof. Vescovi, la scelta nel proseguire la ricerca nelle patologie neurodegenerative

-Cellule staminali neurali: un nuovo approccio cellulare per l’atrofia muscolare spinale; finanziato dalle Fondazioni Onlus Asamsi e Famiglie SMA Italia. (Responsabile con il Prof. A. L. Vescovi).

Inoltre sto attualmente collaborando per il progetto “Ruolo delle cellule staminali nella terapia del glaucoma” (il glaucoma è una patologia neurodegenerativa) con il Professor Luca Mario Rossetti, che svolge attività clinica e di ricerca nel mio Dipartimento e con la dottoressa Valentina Massa (che lavora sempre nel mio dipartimento) per uno studio su patologie neurologiche.”

6.      Quali sono i passi necessari per arrivare a sperimentare sull’uomo le vostre scoperte scientifiche?

“Per poter iniziare una fase clinica 1-2 e che cioè preveda lo studio della sicurezza (che molto probabilmente questo tipo di cellule hanno appartenendo alla classe delle mesenchimali che sono già ampiamente state testate in vari trial clinici) e di efficacia occorrerà prima la validazione da parte di altri laboratori dei risultati che abbiamo ottenuto. Successivamente occorrerà derivare le cellule in modo che siano compatibili con il trapianto nell’uomo ovvero trattarle in condizioni di Good manifacturing practice (GMP) che prevede l’utilizzo di materiali “human grade” allo scopo di ridurre il rischio per il paziente (per patologie prioniche come il ben noto Morbo della mucca pazza ad esempio). Questa procedura è attualmente fuori dalla nostra portata economica dato che necessita di condizioni di sterilità e di purezza che non possiamo ottenere a meno di non costruire dei laboratori appositi.”

7.      Esiste qualche ostacolo particolare che rallenta il vostro lavoro?

“L’attuale situazione finanziaria del nostro paese in cui i tagli hanno colpito molti settori economici e culturali strategici è vissuta, da noi ricercatori, con molta apprensione. Se è pur vero che i finanziamenti debbano essere assegnati a coloro che la ricerca la fanno e quindi la premialità all’eccellenza è una condizione essenziale in questa contingenza (italiana e mondiale), i tagli purtroppo negli ultimi anni hanno toccato anche i gruppi o i ricercatori che producono lavori di qualità. Non c’è quindi che da sperare che questo trend cambi e che eventualmente organizzazioni e associazioni (onlus) possano aiutare finanziando progetti mirati”.

Ringraziamo il dr. Daniele Bottai per la disponibilità e il tempo che ci ha dedicato.

 Cure Girls Arcangela, Marina e Loredana